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    公开号:WO1992015612A1
    申请号:PCT/JP1992/000165
    申请日:1992-02-19
    公开日:1992-09-17
    发明作者:Yoshie Kurihara；Soichi Arai；Keiko Abe；Haruyuki Yamashita
    申请人:Asahi Denka Kogyo K.K.；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 クルクリン Bおよびそれをコードする D N A、
    [0002] 並びにそれらの製造方法 技術分野
    [0003] 本発明は， クルクリン Bおよびそれをコードする D N A、 並 びにそれらの製造方法に関する。 背景技術
    [0004] クルクリゴ . ラチフォリア （Curculigo latifolia ) は、 西マレ一 シァゃタイ南部等に自生するきんばいざさ科（または分類の仕 方によってはひがんばな科） に属する植物である。 このクルク リゴ · ラチフォリアに含まれているタンパク質であるクルクリ ン同族体（以下、 クルクリンという） が味覚修飾物質として有 用であることは、 従来から本発明者らによって確認されている。 そして、 本発明者らは、 特開平 2— 1 0 4 2 6 3号公報にクル クリゴ · ラチフォリアから得られたクルクリンについて記載し、 特開平 2— 8 4 1 5 7号公報にはクルクリンの安定化方法を、 そして特開平 2— 8 4 1 6 0号および特開平 2—8 4 1 6 1号 各公報にはクルクリンの加工方法を開示している。 更に、 特開 平 3— 1 9 0 8 9 9号公報にはクルクリン同族体のひとつであ るクルクリン A (以下、 クルクリン Aという） について全アミ ノ酸配列を記載している。
    [0005] しかしながら、 前記の特開平 2— 1 0 4 2 6 3号、 特開平 2 —8 4 1 5 7号、 特開平 2— 8 4 1 6 0号、 特開平 2— 8 4 1 6 1号及び特開平 3 - 1 9 0 8 9号の各公報に記載の技術で は、 クルクリゴ · ラチフォリア植物体から抽出しているためク ルクリンの大量生産が困難であった。 また、 クルクリゴ■ ラチ フオリァ植物体の処理は容易でなく、 しかも抽出法によって得 られたタルクリンは、 それ自体の活性が低下しやすいという問 題点があった。
    [0006] 本発明者は、 クルクリンの大量生産手段を提供することを目 指して、 既に解明したクルクリン Aのアミノ酸配列を利用して ォリゴヌクレオチドを作成し、 このオリゴヌクレオチドをプロ ーブとして用いてクルクリン B (以下、 クルクリン Bという） をコードする c D N Aをクローン化することに成功し、 更にこ のクローン化 D N Aを組込んだプラスミドで形質転換させた微 生物がタルクリン同族体のひとつであるクルクリン Bを産生す ることを確認し、 本発明を完成した。 発明の開示
    [0007] 従って、 本発明は、 本質的に純粋なクルクリン Bに閬するも のである。 ここで、 本質的に純粋なクルクリン Bとは、 特には クルクリゴ ·ラチフォリァ由来の他のタンパク質を実質的に含 有しないタンパク質であり、 本発明により、 組換宿主細胞によ つて産生することができる。
    [0008] また、 本発明は、 クルクリン Bをコードする塩基配列を含む D N Aにも関する。
    [0009] 更に、 本発明は、 クルクリン Bをコードする塩基配列を含む 組換 D N Aを含有する形質転換微生物または細胞を培養して前 記形質転換微生物または細胞にクルクリン Bを産生させ、 その クルクリン Bを前記形質転換微生物または細胞から単離するこ とを特徴とする、 クルクリン Bの製造方法にも関する。
    [0010] 更に、 本発明は、 クルクリゴ · ラチフォリアからクルクリン BmRNAを含む画分を分離し、 逆転写酵素を用いて前記 mR NAから単鎖 c DNAを作成し、 この単鎖 c DNAから二重鎖 cDNAを作成し、 この二重鎖 cDNAをベクターに挿入し、 このベクターにより宿主を形賓転換させて c DNAライブラリ 一を作成し、 クルクリゴ ' ラチフォリアから精製したクルクリ ン Aを用いて分析した部分アミノ酸配列をコードする塩基配列 を含む合成 DNAをプローブとして用い、 前記ライブラリーか らクルクリン Bをコードする cDNAを単離することを特徴と する、 クルクリン Bをコードする塩基配列を含む DNAの製造 方法にも関する。 図面の簡単な説明
    [0011] 第 1図は E c o R Iアダプターの構造を示す β
    [0012] 第 2図はクルクリン Βをコードするクローン化 DN Αの制限 酵素地図である。
    [0013] 第 3図はプラスミド PQ9の構造を示す。
    [0014] 第 4図は発現プラスミドの作成過程および構造を示す。
    [0015] 第 5図は電気泳動およびそのウェスタン分析の結果を示す。 第 6図はクルクリゴ · ラチフォリアの果実から水洗、 抽出、 塩析操作によって得た味覚修飾物質の CM—セファロースィォ ン交換クロマトグラフィーの溶出パターンを示すグラフである。 第 7図は第 6図のピーク （B)の斜線部分に示された画分の、 セフアデックス G— 100分子ふるいクロマトグラフィ一の溶 出パターンを示すグラフである。
    [0016] 第 8図は高純度クルクリン Aからなる味覚修飾物質の活性を 示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
    [0017] クルクリンは、 プレペプチドまたはプレプロペプチドを含む 前駆体（未成熟体） の形で植物細胞内に産生され、 プロセシン グによりこのプレぺプチドまたはプレプロべプチドが脱離して 成熟体になるものと推定される。 本発明者が見出したところに よれば、 成熟クルクリン Bは以下の式（ I ) で表されるァミノ 酸配列に示すアミノ酸 1 1 4個からなる ：
    [0018] Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gin Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gin Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr lie Gin Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gin Asn Gly Arg Gin lie Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val lie Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Tip Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gin Lys Asp Gly Arg Phe Val lie Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn. Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly ( I ) β また、 クルクリン B前駆体は以下の式（Π ) で表されるァミノ 酸配列に示すアミノ酸 1 5 8個からなる ：
    [0019] Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr lie Leu Val Thr Phe Ala Ala Val Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gin Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gin Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr lie Gin Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gin Asn Gly Arg Gin lie Tip Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val lie Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Tip Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gin Lys Asp Gly Arg Phe Val lie Tyr Gly Pro Val Leu Tip Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly Gly He Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro GlnHis Glu Asplle Lys Met Val He Asn Asn (II) 。
    [0020] 従って、 本発明は、 式 （ I ) または式 （Π) で表されるァミノ 酸配列からなるクルクリン B成熟体またはクルクリン B前駆体 をコードする塩基配列を含むことを特徴とする DNA、 更に、 クルクリン B成熟体またはクルクリン B前駆体を微生物や培養 細胞によって生産するために、 前記塩基配列に開始メチォニン をコードする AT Gが結合した塩基配列からなる DN Aにも鬨 する。
    [0021] 天然または人工的変異により、 主要な活性を変化させること なく、 DN Aの構造または対応するペプチドの構造の一部を変 化させることができる。 従って、 本発明の前記各 DNAは、 前 記の全てのボリペプチドの相同変異体に相当する構造を有する ， ポリペプチドをコードする塩基配列を含有する D N Aも包含す る。
    [0022] クルクリン Bをコードする DN Aは、 以下の方法によって得 ることができる。
    [0023] ( A) mRNAの抽出
    [0024] クルクリンを特に高濃度で産生する、 クルクリゴ · ラチフォ リアの果実を粉末状にし、 この粉末試料から RNAを抽出する。
    [0025] RNAの抽出は、 グァニジンチオシァネート法〔Maniatisら ： Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
    [0026] Laboratory^iew York,(1982)〕 、 またはフエノール ' S D S法 〔B rawe rmanら： B i o chemi s t r y , 11 , 637— 641， （ 1972 ) 〕 を用いて行うことができる。 グァニジンチオシァネート法は、 試料にグァニジンチオシァ ネート液を添加後、 ホモジナイズする。 得られたホモジネート を、 スィングローター用ポリアロマーチューブに入れて遠心し、 RNAの沈殿を得る。 この RNAの沈殿を精製して mRNAを 得る。
    [0027] フエノール . SDS法は、 試料粉末に、 フヱノール、 EDT Aおよび SDS含 ¾ ^トリス塩酸緩衝液、 並びにジチオスレィ卜 ールを添加して水層を得る。 得られた水層には多糖類等の RN A以外の物質が含まれているので、 塩化リチウムなどによる塩 析操作を行って、 RNAの沈殿を得る。 続いて、 RNA沈殿を 適当な溶媒に再溶解し、 オリゴ（ dT)カラムにより mRNA を精製して抽出する 〔 A V i Vら Proc.Natl.AcaiSd.U.S.A«69， 1408-1418,(1972)参照〕 。 本発明においては、 タルクリゴ'ラチ フォリア等の植物体の細胞膜が固いので、 フエノール . SDS 法を用いるのが好ましい。
    [0028] ( B ) c DNAの合成およびベクターへの c DNAの揷入 cDNAの合成には、 岡山—バーグの方法〔Ok a yam a ら： Mo l . Ce l l B i o l . 2, 161, (1982) 〕 、 またはグブラーホフマンの方法〔Gu b i e rら： Ge ne 25, 263, ( 1983 ) 〕等を利用することができる。 岡山一バーグ法を以下に説明する。
    [0029] ① PBR322— SV40ベクター用アラスミドを、 制限酵素 KP n Iで切断した後、 オリゴ dTを添加する。 次に、 制限酵 素 a Iを反応させた後、 オリゴ d Aセルロース （フアルマ シァ L KBバイォテクノロジ一社製〉 カラムを用いて dTの付 加していないものやオリゴ dTの短いものを除いて、 ベクター プライマーを調製する。
    [0030] ②次に、 別の P BR322— SV40融合プラスミド DNAを 制限酵素 _£_§_LIで切断して精製した後、 オリゴ dG鎖を付加 して、 制限酵素 JiljL niで切断される塩基配列をもつリンカ 一 DNAを調製する。
    [0031] ③精製した niRNAと、 ①で調製したベクタープライマーとを 混合し、 逆転写酵素により cDNAを合成する。
    [0032] ④合成した c DN Aを融合させたプライマーにオリゴ dG鎖を 付加した後、 H i n dillにより消化し、 c D N Aが融合した端 部とは反対側のォリゴ d G鎖付加部分を除去する。
    [0033] ⑤前記の②で調製したオリゴ dG鎖をもつリンカー DNAと、 ④で調製したベクタープライマー DNA— mRNAハイブリツ ドとを、 T4リガーゼ等の DNA結合酵素を用いて i jL ni 断片をつないで環状化した後、 リボヌクレアーゼ Hで RN Aを 部分的に消化する。 続いて、 RNA断片をプライマーとして D NAボリメラーゼIでRNA鎖をDNA鎖に置換し、 T4リガ ーゼでつないで二重鎖環状 D N A.に調製する。
    [0034] ⑥コンビテント細胞を調製後、 形質転換を行い、 アンピシリン を含有する培地 （例えば、 ； 一ブロス、 LB—ブロスまたは Υ Τ一ブロス） で培養して目的とする DNAを含有するコロニー を得ることができる。
    [0035] 次に、 グブラ一—ホフマン法を説明する。 この方法では、 ベ クタ一に A g t l O、 A gt l l、 λ ZAP等を用いることが できる。 ①精製した mRNAのポリ A部にァニールさせたオリゴ dTを プライマーとし、 逆転写酵素を用いて第一鎮 cDNA (または s s c DNA) を合成する。
    [0036] ②前記①で調製した cDNA— mRNAハイプリッドに、 リボ ヌクレアーゼ H等のエンド型 RN A分解酵素を加えて mRNA を消化した後、 dATP、 dTTP、 dGTPおよび dCTP を添加し、 DNAポリメラーゼ Iまたはクレノウ断片等と反応 させて、 第二鎖 cDNA (または d s cDNA) を合成する。
    [0037] ③前記②で調製した d s c DNAは、 T4DNAポリメラーゼ 反応により両端をそろえ、 E c oR Iメチラーゼにより Έ c o R I部位をメチル化した後、 Ec oR Iリンカ一を両端に付加 し、 Ec oRI消化を行う。
    [0038] ④前記③で調製した Ec oR I消化 c D N Aと Ec oR I消化 Agtベクターとを T4リガーゼによりライゲイシヨンした後、 パッケージングを行って、 ライブラリーを作成する。
    [0039] 以上のようにして、 cDNAの合成およびベクターへの cD N Aの組み込みを行うが、 本発明においては、 後述の実施例で 示すとおりグブラ一一ホフマン法により行うのが好ましく、 ベ クタ一としては A gt l 0を用いるのが好ましい。
    [0040] (C) プローブの作成
    [0041] クルクリン Aは、 既に本発明者等によってクルクリゴ ·ラチ フォリア植物体から精製され、 そのタンパク質の全アミノ酸配 列が解明されており、 特開平 3— 190899号公報に記載さ れている。 このアミノ酸配列の適当な部分を選択してプローブ を作成することができる。 プローブとして用いる DN Aの合成 には、 公知の方法〔例えば、 DNA自動合成機を利用するホス ホアミダイ ト法、 日本生化学会編：遣伝子研究法 I , 1ー27, ( 1986 ) または Mat t e u c c iら ： Tetrahedron Lett., 21,719,(1980)〕 を使用することができる。
    [0042] (D ) スクリーニング
    [0043] B項で作成された cDNAライブラリーからの、 目的遣伝子 を含むプラークのスクリーニングは、 C項で作成されたプロ一 ブを用いて行うことができる。 まず、 プラークをナイロンメン ブランまたはニトロセルロース等のフィルターメンブラン上に 焼き付ける （ペイキング） 。 また、 C項で得られたそれぞれの プローブを、 Man i at i sらの前述の文献に記載の方法等 により 〔32P〕 等の放射性同位体でラベルする。 上記のフィルタ ーメンブラン上に焼き付けたプラークと、 上記32 P等でラベルし たプローブとをハイブリダィゼーシヨンさせ、 目的遣伝子を舍 むプラークのスクリーニングを行うことができる。
    [0044] 更に、 cDNAライブラリーからの、 目的遣伝子を含むプラ ークのスクリーニングに、 G l ove r : DNA
    [0045] C l o n i n , 1 , 51 -52, I RL P r e s sに記載 されている方法を用いることもできる。 即ち、 目的とする cD N Aから発現したタンパク質の活性を検出したり、 そのタンパ ク質に特異的な抗体を用いて目的とする c D N Aから発現した タンパク質を検出することにより、 目的とする cDNAを同定 する、 抗体によるスクリーニング方法である。 しかしながら、 本発明においては、 プラークハイブリダィゼイシヨン （または コロニーハイブリダィゼイシヨン） による方法が望ましい。
    [0046] ( E ) サブクローニング
    [0047] サブクローニングに用いるベクターとしては、 例えば p UC 系列 （例えば、 PUC7、 pUC8、 pUC9、 pUC 18ま たは pUC l 9 ) または P BR系列 （例えば、 P BR322、 P BR325または P BR327 ) のプラスミドを挙げること ができ、 特に P UC 18を用いるのが好ましい。 前記のスクリ 一二ング工程によって選択されたプラークまたはコロニーから ファージ DN Aまたはプラスミド DN Aを取り出して精製し、 適当な制限酵素で消化し、 サブクローニング用ベクターに挿入 する。
    [0048] こうして得られる組換えベクターを、 例えば、 Hanahanら ： Mo 1. B i o l . 166, 557 - 580, ( 1983 ) に 記載の方法によって、 コンビテント細胞に導入する。 宿主細胞 としては、 大腸菌 12株由来のもの、 例えば、 HB 101ま たは MM 294、 MC 1061、 C600、 DH 1、 JM 109等を挙げることができる。 こうして得られた形質転換体 を、 例えば、 Man i at i sらの前述の文献に記載の方法、 例えば、 ィソプロピル一 ー D—チォガラクトピラノシド （ I PTG) を用いる方法によって選定することができる。
    [0049] ( F ) プラスミド DNAの調製
    [0050] サブクローニングによって得られたクローンから、 例えば、 Man i a t i sらの前述の文献に記載のアルカリ一 S D S法、 またはボイリング法によってプラスミド DN Aを精製すること ができる。 必要により、 塩化セシウム超遠心法を用いることも できる。
    [0051] (G) cDNAの構造解析
    [0052] F項で得られたプラスミド DNAを、 各種の制限酵素で切断 して制限酵素地図を作成する。 更に、 ジデォキシ法 CSangerら ： J. Mo 1. B i o l . 143， 161 - 178, ( 1980) 〕 等によって、 ヌクレオチド配列を決定する。
    [0053] (H)発現
    [0054] F項で得られたプラスミド DNAを利用し、 例えば、 Maniatis らの前述の文献に記載の方法により、 大腸菌 YA 21株のコン ピテント細胞を形質転換してタルクリン Bを発現させることが できる。 発現用の宿主細胞としては、 前記の大腸菌 YA 21株 の他、 大腸菌 MM294、 DH 1、 DH5、 JM109、 HB 101、 GC 508または CE S 201等を挙げることができ る。
    [0055] 更に、 本発明で利用することのできるベクターとしては、 C o 1 E 1系プラスミドベクターである、 P UC系 （例えば、 pUC7、 P UC8、 P UC9、 pUC 18、 P UC 19 ) 、 P BR系 （例えば、 P BR322、 P BR325. p BR 327 ) 、 更に、 それらに由来する P TV 1 18、 PUC 1 18、 pUC 119等を挙げることができる。 また、 ファー ジ系ベクターとしては、 λファージ由来の A gt 10、 λ g t 1 1、 Cha r o n4A、 λ g t WE S - λ B . EMBL3、 E MB L 4等を挙げることができる。
    [0056] また、 酵母用の発現べクタ一としては、 例えば、 PYES 2. 0、 PAH9、 pMAC 561、 P LG669. pMA 91、 PAM82、 PMC2010、 pOP、 pTE432、 P SD 922等を挙げることができ、 枯草菌用の発現ベクター としては、 例えば、 P P L608、 pKTH50、 P KTH 51、 p KTH 53. pKTH38、 pHY300、 pLK等、 そして、 動物細胞 （例えば、 COS— 7細胞、 Bowe s黒色 腫細胞、 CHO細胞）用の発現ベクターとしては、 例えば、 pMT、 pSV、 pCD、 pMDSG、 pBPV等を挙げるこ とができる。
    [0057] 得られた形質転換体を適当な公知の培地において、 細胞密度 が十分な濃度に達するまで培養する。 続いて、 例えば超音波処 理して細胞を破碎し、 その破砕液を公知の方法によって処理し てクルクリン Bを精製することができる。 こうして得られたク ルクリン Bは、 味覚修飾剤、 食品、 医薬品等に用いることがで さる。 実施例
    [0058] 以下、 実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、 こ れらは本発明を限定するものではない。
    [0059] 実施例 1 ： RNAの抽出
    [0060] クスレクリゴ ·ラチフォリアの果実（開花直後から完熟まで、 即ち 0週から約 8週までの各段階の各種果実を混合したもので あって、 果実全体をそのまま使用したので、 果実の皮、 種およ び果肉などの果実の全ての成分が含まれる）約 6 gをドライア イスによって凍結し、 解凍しないようにして粉砕し、 粉末 5g を得た。
    [0061] 得られた粉末 5gに、 フエノール 15m l、 0. 1Mトリス 塩酸緩衝液（PH8. 5、 5mM— EDTA、 1%SDS) 15m 1および 1 Mジチオスレィトール 600〃 1を力 IIえ、 直 ちに激しく振盪した。 遠心分離により水層をとり、 フエノール 抽出をさらに 3回行った。 得られた水層には、 多糖類等の RN A以外の物質が含有されているので、 1. 05容量倍の 5M塩 化リチウムを加え、 4 で 2時間放置した後、 遠心分離して R N Aを沈殿状態で得た。 次いで、沈殿物をエタノールで処理し、 RNA768〃 gを得た。
    [0062] 実施例 2 ： mRNAの抽出
    [0063] 実施例 1で得られた R N A 768 t gを熱変性（ 65で、 10分閬） した後、 この熱変性 RN Aを含有する 0. 5M塩化 ナトリウム溶液を調製し、 この溶液をオリゴ（ dT) カラム (フアルマシア L KBバイオテクノロジー社製の mRNA精製 用スパンカラム） に通した。 0. 5M塩化ナトリウム溶液によ り非吸着画分を除去した後、 塩化ナトリウムを含まない溶出液 により溶出して、 高潘度で存在する mRNAを 8 g得た。 実施例 3 ： c DNAの合成
    [0064] 市販の c DNA合成キット （ c DNA Synt he s i s K i t : フアルマシア L KBバイオテクノロジー社製） を用 いて、 mRNAから s s cDNA、 更には d s c DNAを合成 し、 クレノウ断片で平滑末端としてから Ec oR Iアダプター を連結した。
    [0065] 即ち、 オリゴ d (T) 12.18プライマー、 モロニ一 ·マウス白血 病ウィルス （MMLV) の逆転写酵素、 dATP、 dCTP、 dGTPおよび dTTPを含むバッファー （F i r s t— St r and Re ac t i o n M i x ) に、 熱変性した m RN A 4 gを含有する RNァーゼ不含水 20 JUL 1を加え、 37°Cで 1時間反応させた。 次に、 RNァーゼ H、 DNAボリ メラーゼ I、 dATP、 dCTP、 dGTPおよび dTTPを 含むノ ッファー （ Second-Strand Reaction Mi ) に前記の反応液 を加えて全量を 100〃 1とし、 12eCで 1時間、 続いて 22 でで 1時閭反応させた。 反応終了後、 クレノウ断片 1 1を加 えて 37。Cで 30分閭反応させた。 フエノール Zクロ口ホルム 1 00 1を加えてから 1分間遠心し、 上部の水層をスパン力 ラムで精製した。 カラム溶出液 1 00〃 1に E c o R Iァダプ ター（構造を第 1図に示す）溶液 4 1 、 ATP溶液 1 1お よび T4DNAリガーゼ 3〃〗を加え、 穏やかに攪拌して短時 間遠心した後、 1 2でで一晩反応させた。 反応液を 65 で 1 0分間加熱して DNAリガーゼを変性させ、 氷冷してから A TP溶液 1 1および Τ4ポリヌクレオチドキナーゼ 1〃 1 を加え、 穏やかに攪拌した後、 37eCで 30分間反応させた。 反応液にフエノール Zクロ口ホルム 1 00 X 1を加えてから 1 分間遠心し、 上部の水層をスパンカラムで精製し、 E c o R I アダプター連結 d s c DNAを得た。
    [0066] 実施例 4 ：ベクターへの c DN Aの揷入 、
    [0067] E c o R Iで切断してからアルカリ ·ホスファターゼで処理 して脱リン酸化したス g t 1 0の E c o R I部位に、 実施例 3 で得られた E c oR Iアダプター連結 d s c DNAを連結した。 始めにテストライゲーシヨンを行って、 最良の混合比を求め た。 即ち、 実施例 3で得たカラム溶出液（ d s C DNA5. 0 n g、 1 5. O n gまたは 40. 0 n g含有液となるように力 ラム用緩衝液で希釈） 30〃 1に λ g t 1 0の 2〃 1を加え、 3 M酢酸ナトリウム 3 1および冷エタノール 6 O j 1を加え て混合した後、 一 7 CTCで 1 5分間冷却した。 1 0分間遠心し て得た沈殿を乾燥し、 乾燥 c DNAをカラム用緩衝液 9 1に 再懸濁し、 丁 溶液1〃 1および T4DNAリガーゼ 1〃 1 を加えた。 攪拌後、 遠心処理してから 1 2eCで 1 6時間反応さ せた。 続いて、 Man i at i sらの前述の文献に記載の方法 により、 イン 'ヴィトロパッケージング（Giga pack gold) を行 い、 組換えファージを大腸菌 c 600 h f 1に感染させたとこ ろ、 40 n gの E c o R Iアダプター連結 d s c DNAに対し て 0. 3 gの A gt 10を混合した場合に最良の結果を与え ることが分かった。 そこで、 この量比で、 ライゲーシヨンおよ びパッケージングをスケールアップして実施し、 約 30万個の 独立したプラークからなるライブラリーを作製した。
    [0068] 実施例 5 ： スクリーニング
    [0069] 特開平 3— 190899号公報に記載されたクルクリン Aの アミノ酸配列に基づいて、 以下の 3種のプローブを作製した。 以下の塩基配列で、 Nは A、 C、 Gおよび丁、 Hは A、 Cおよ び T、 Dは A、 Gおよび T、 Rは Αおよび G、 Kは Gおよび T、 そして Υは Cおよび丁の、 それぞれデォキシリボ核酸残基を示 す。 また、 合成方法は、 日本生化学会編の前述の文献（遣伝子 研究法 I ) に記載の方法を使用した。
    [0070] ( 1 ) l i e— G i n— As n— As n— Cy s_As n (成 熟クルクリン Aのァミノ末端より 25位から 30位まで） に基 づくセンス DNAプローブ（ 17me r ； 48種） ：
    [0071] 5，一 ATH— CAR— AAK— AAK— TGY— AA— 3，
    [0072] ( 2 ) Ty r— G l n— As n— G l - A r g -G 1 n -
    [0073] I 1 e-Tr p-A 1 a ( 34位から 42位まで） に基づくァ ンチセンス DNAプローブ（ o26me r ; 1536種） ：
    [0074] 5，一 GC - CCA - DAT - YTG - NCK— NCC— RTT -YTG-RTA-3'
    [0075] ( 3 ) P h e - V a 1 - I l e— Ty r— G l y— P r o— Va 1 ( 94位から 100位まで） に基づくアンチセンス DN
    [0076] Aプローブ（ 20 m e r ； 768種） ：
    [0077] 5,— AC— NGG— NCC— RTA— DAT— NAC—
    [0078] RAA-3'
    [0079] これらの各プローブは、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを使 用して、 〔ァ一 32P〕 dATPにより 5' 末端をラベルし、 以下 の実施例 6に使用した。
    [0080] 実施例 6 ：プラークハイブリダィゼーシヨン
    [0081] 実施例 4で得られたライブラリーのプラークをナイロンメン. プレンに移し、 DN Aを固定した。 続いて、 実施例 5で調製し たプローブ（ 1 )〜（ 3 ) で順にハイブリダィゼーシヨンを行 つた。 ハイブリダィゼーシヨンの温度は、 プローブ（ 1 )が
    [0082] 33〜34で、 プローブ（ 2 ) が 55。C、 プローブ（ 3 )が
    [0083] 45〜46°Cとした。 また、 洗いの条件は、 プローブ（ 1 )〜 ( 3 ) のいずれも 6 X S SC ( I X S SCは、 0. 15 M塩化 ナトリウム、 0. 015Mクェン酸ナトリウム） とし、 温度は それぞれのハイブリダィゼーシヨン溫度と同温度とした。 こう して、 約 30万個のプラークからすべてのプローブとハイプリ ダイズするプラーク群 16個を得た。
    [0084] 実施例 7 ：シングルプラークの分離
    [0085] 実施例 6で得た 16個のプラーク群の各々について 2次スク リーニングを実施した。 即ち、 各プラーク群を独立のプラーク に別け、 実施例 6と同様にプローブ（ 1 )〜（ 3 ) と次々にハ イブリダィズさせた。 プローブ（ 1 )〜（3 ) の全てにハイブ リダィズするプラークが、 16個のプラーク群の各々から 1個 づっ得られた。 こうして得られたプラークをファージ久 Q 1〜 AQ16と命名した。 これらのファージ AQ1〜AQ16から ファージ DNAを取り出し、 Jjg_g_R Iで消化し、 電気泳動に よってインサート分子 iを比較したところ、 ファージ AQ9に 含まれるインサートが最長（約 1. 2kbp ) であった。
    [0086] 実施例 8 ：サブクローニング
    [0087] PUC 18を用いて、 ファージ AQ9に含まれるインサート をサブクローニングした。 即ち、 ファージ AQ9から、 例えば、 日本生化学会編：続生化学実験講座 I， 遣伝子研究法 2，
    [0088] 100, ( 1986 ) に記載の方法によりファージ久 Q 9の D NA30〃gを精製し、 100ユニットの Ec oR Iを用いて 消ィ匕し、 クルクリンをコードする Ec oR I断片 400 n gを 調製した。 一方、 _g_2_R Iで切断してからアルカリ ·ホスフ ァターゼで処理して脱リン酸化した PUC 18 ( 50 ng) を 調製し、 前記 Ec oR I断片 100 n g、 T4リ¾ 'ーゼ 1. 0 1含有ライゲーシヨン緩衝液（ 0. 01mMATP、 6. 6 mM塩化マグネシウム、 1 OmMジチオスレィトールを含む 66 πιΜトリス塩酸緩衝液， ρΗ7. 6 ) 20 u Iを加え 12 eCで 16時間ィンキュペートしてライゲーシヨンした。
    [0089] 続いて、 Han ah anらの前述の文献に記載の方法によつ て形質転換を行った。 即ち、 形質転換用に調製された大腸菌 M M294のコンビテント細胞 210〃 1に、 前記の cDNA —プラスミド DNA100 ng含有緩衝液 5〃 1を加え、 0。C で 30分間および 42 Cで 80秒間静置した後、 氷冷し、 SO C培地 800 / 1を加え、 37eCで 1時間振盪した。 続いて、 アンピシリン 50 /gZm 1を含有する ブロス寒天培地で 37 eCにて培養し、 プレート 1枚当たり約 100個の形質転換 体を得た。
    [0090] 実施例 9 ： コロニーハイブリダィゼーシヨン
    [0091] 実施例 8で得たプレートのレプリカを常法によって変性およ び焼付処理して DNAを固定した。 前記実施例 5で調製したァ ローブ（2 ) を用い、 55'Cでハイブリダィズさせ、 同じ温度 にて 6 XS SCで洗った。 陽性クローン 75個が得られた。 実施例 1 0 ： プラスミド DNA
    [0092] 実施例 9で陽性とされた形質転換体 1個を、 アンビシリン 50〃 gZm 1含有の; 培地 3 Om 1に植え継ぎ、 37 で一 晚振盪培養した後、 4 eCで遠心（ 2000 X gにて 7分閬） し、 菌体約 20 O zgを得た。 この菌体約 20 Oju gを、 リゾチ一 ム （ 1 OmgZm 1 )含有 25 mMトリス塩酸緩衝液（ 50 mMグルコースおよび 1 OmMEDTA含有、 pH8. 0) 800 Z 1に溶解した後、 Ma n i a t i sらの前述の文献に 記載の方法により、 プラスミド （以下、 プラスミド PQ9と称 する） DNA約 20 xgを得た。 このプラスミド P Q9の構造 を第 3図に示す（第 3図の挿入部において、 矢印はクルクリン Bをコードする DNAの挿入方向を示す） 。
    [0093] 実施例 11 ：制限酵素地図の作製および塩基配列の決定
    [0094] プラスミド PQ9を種々の制限酵素で切断し、 第 2図に示す ような制限酵素地図を作製した。 更に、 各種の DNA断片をジ デォキシ法（Sange rらの前述の文献参照） によって、 そ のヌクレオチド配列を決定した。 結果を以下の第 1表に示す。 第 1表には、 塩基配列から演繹されるアミノ酸配列も示す。 な お、 第 2図において斜線部分はコード部分を、 矢印は塩基配列 を決定した方向を示す。 また、 第 1表の配列において、 5 ' 側 および 3' 側非翻訳領域の塩基配列は 1例である。 即ち、 ファ ージ AQ1〜ファージ AQ16の中で、 ファージ 9以外の ファージを用いて前記と同様に処理して塩基配列を決定すると、 第 1表の配列に示す 5' 側および 3 ' 側非翻訳領域の塩基配列 とは部分的に異なる塩基配列を有するものが見出された。 第 1表
    [0095] C GC AAAGAC A ATG GCG GC C AAG
    [0096] Me t A l a A 1 a し y s
    [0097] -20
    [0098] TTT CTT CTC ACC ATT CTT GTC
    [0099] P h e Le u Le u Th r l i e Le u V a 1
    [0100] 一 15
    [0101] ACC TTT GCG GC C GTC GCT AGC
    [0102] Th r P h e A l a A 1 a V a 1 A l a S e r
    [0103] - 10 一 5
    [0104] CTT GGC ATG GCC GAC AAT GTC
    [0105] Le u G 1 y Me t A 1 a As p As n V a 1
    [0106] CTG CTC TCC GGG C AA ACT CTG
    [0107] Le u Le u S e r G 1 y G i n Th r Leu
    [0108] 5 10
    [0109] CAT GCC GAC C AC TCT CTC C AG
    [0110] H i s A l a As p H i s Se r Le u G i n
    [0111] 15 0 L
    [0112] I ·ΒΛ <3 s v u s v u s v u s v s τ H
    [0113] ΌΌ OVO OVV OVV OVV OVO
    [0114] ≤ 9 09 d S V j 丄 I I ΒΛ n 9 u s v ^ ΐ Ό OVO OV丄 O丄 V 丄丄 Ό OvLO OVV ΌΌΌ d s v J. ^ S n Θ q n θ Ί q丄 n θ q S Λγ OVO J.O V Ό Ο Ό丄丄 VOV OvLO OOO
    [0115] 0≤
    [0116] s A I Ό ^ 3 S ^ I Ό S S ay d s v OO L ΟΌΌ 〇〇丄 OOO ΌΌΟ OOV OVO ≤ 0
    [0117] ¾丄 u s v J 9 S ¾ I V 3 Ϊ I u Ϊ O J.OV OVV OOV 丄 DO OO , 丄 V OVO
    [0118] § α V I D u s v u I o 丄 s I ΒΛ OOV ΌΌΌ OVV OVO 0 VJL VVV O O
    [0119] 0 ε ≤ z n 9 q u s v u s v u ΐ Ό θ ΐ I Ό丄 D OVV 〇3丄 OVV VVO V V
    [0120] 0 Z
    [0121] -Ϊ q丄 n 9 q 丄 丄 •e ΐ v ^ ΐ Ό ^ ΐ V oov V丄丄 OOV 丄 V丄 OOO ΌΟΌ
    [0122] OZ
    [0123] S9l0d/Z6d£/JDd d s v n I o s ΐ H u ΐ O 0 -t d n I o Λ ^ 丄 VO ΌΥΌ VVO V00 VVO JLO V
    [0124] O Z l
    [0125] α θ S d s v S A "~l B ΐ V 1 ΒΛ J q丄 9 Ϊ I O VO OVV 丄 €> 丄丄 > VOV 0丄 V S I T 0 I T
    [0126] ^ ΐ O ^ t Ό u s v ΐ ΒΛ S y S J v s f Q VOO 丄 ΌΌ JLVV 丄丄 丄 Ό〇 OOO 03丄
    [0127] S O T
    [0128] ^ T Ό u s v o J d 尺 ΐ Ο π 3 q J θ S d «i丄
    [0129] OOO 丄 VV JLOO ΟΌΌ 丄丄 O 〇丄 丄
    [0130] o o τ ≤ 6 n 3 q I T3 o -i j & ΐ Ό •I 丄 3 T I I Β.Λ
    [0131] Ό丄丄 丄丄 O Ό00 丄 V丄 0丄 V 丄 Ό
    [0132] 06
    [0133] 3 d ν ΐ Ό d s ν s q u ο η Θ 丄丄丄 VOV 0ΌΟ VO OVV Ο VO 丄丄 D
    [0134] ≤ 8
    [0135] I A n a q B I V "丄 S i 1 A i o u s v 丄丄3 丄丄 00 丄 V丄 OVV OOO OVV 08 ≤ L
    [0136] d s V ^ ΐ Ό d α χ s ^ ΐ V -ί θ S ^ ΐ Ό
    [0137] DV ΌΌΌ OO L OOX OOO 0Ό V OOO
    [0138] IZ
    [0139] S9lO /Z6df/J3d[ ATT AAG ATG GTG ATT AAT AAT l i e L y s Me t V a 1 l i e A s n A s n 130 135
    [0140] TAATCAAGTG AGAGGATTGT TATGAGAATA ATGAGTGGAA
    [0141] 1OGAAGACCA ATCTCATGTC GGTGTGGCCT ATCTCCACCT G1T GCAGTG C ITIU'ITAA AATAACACAT TGGGGAATAA TAAAGTGAAA CTATATAGAT TGGTTCAGCA AATTTTCTGT TCAGTTTrCC TCTCACA GT CAATGTCGAT TTTTTGCCGC GGATCATACA TGTGCTTGGT ATTCTAATCG ATAGAATTAT GGCTCAAATG GAGGCAGGGA TTATGAGAGT TTATTCGfCAT CTCCGGGTCr TCCAACTTAC GAATTATAAC AAGATTCAAG GATGCATCTG AGAGCCAACT TAACGTCTTA CATCAAAGGA GCTAGCCGAA GTTTATTCCC AGAGCTAGAG GAAGTTCGCT GCCATGGTTG ATAGTACAAG TAGAACGACG CATCTAT GC TTCCAGGAAT CACTTCCAGC TTCTCGACAC CTCCAGTGGC CTTTTCACCA CCGAAAGCAC CACCAATTTC AGCACCATIO GTAGGTATAT TTACATTAAC AATACCACAG TCACTGCCAT GGGGTCCAAT CCACTTGAAA ATAACITCAG GTCTACGAGT GAAAATAGAA CTGCITAAAC 1 GCGGTACA GAGTTATITA TTTCAATTGC T CTTTCAGA GTCTGGAATT TCATTACGTA AA (III) 。
    [0142] 実施例 12 :発現
    [0143] Han ah a nらの前述の文献に記載の方法によって発現用 ベクターを作成した。 即ち、 プラスミド P Q9 ( l Ou g) を E c oR Iで消化し、 クレノウ断片（ 1. 0〃 1 ： 5. 0ュニ ット） で平滑化して、 クルクリン Bをコードする DN A断片 (約 1. 2 k b p ) を得、 その DNA断片 100 n gを H i n cllで消化した pUC 18 ( 50 n g ) に挿入して組換えプラス ミドを作成した （第 4図参照） 。 一方、 大腸菌 YA21株を力 ルシゥム法によりコンビテント細胞にし、 前記の組換えプラス ミドで形質転換した。 形質転換体を、 アンピシリン 50 m 1を含有する ブロス培地 0. 2m lに植菌し、 37 で1 8時間培養した。 次いで、 菌懸濁液を遠心分離（ 3000 X g にて 10分間） し、 得られた沈殿約 5 gを M9培地 1. Om 1に懸濁して、 予備培養した。 その後、 イソプロピル一 /3— D —チォガラクトピラノシド （ I PTG) を 1 mMの濃度で添加 し、 2時間培養した。
    [0144] 実施例 13 ：抗血清の調製
    [0145] 後記参考例 4で調製し、 参考例 5で確認したクルクリン A 1 mgZAm 1を含む 0. 1 M P B Sリン酸生理的緩衝液 (PH7. 6 ) を抗原原液（ 1回分） とし、 抗原原液 4m lを それぞれ等量のフロイント完全アジュバンド （FCA) 、 およ びフロイント不完全アジュバンド （F I A) と混合して得られ た油中水型ェマルジヨンを、 FCA抗原溶液および F I A抗原 溶液とした。 前記 FC A抗原溶液 2m 1をゥサギ（体重約 1. 5 k gの雌 2匹） の左右両モモに筋肉注射して免疫した (初回免疫） 。 初回免疫から 1週間経過後、 F I A抗原溶液を 用いたこと以外は初回免疫と同様にして免疫を行った （追加免 疫） 。 追加免疫から 1週間経過後、 ゥサギの血液 3 Om 1 羽 を採取し、 得られた血液を室温で約 2時間放置した後、
    [0146] 3500回転で 5分間遠心分離し、 その上清を更に 10000 回転で 20分間遠心分離し、 その上清から抗クルクリン A抗体 を含む抗血清を調製した。 不溶性プロテイン Aを活性吸着体と して用いたカラムクロマトグラフィー（カラム 1. 0X4. 0 cm、 自然落下） により抗血清を処理し、 精製抗血清を調製し た。
    [0147] 実施例 14 ：ウェスタン分析
    [0148] 実施例 12で得られた細胞を、 ImM— PMSF (フヱニル メタンスルホニルフルオリド〉 を含有する 1 OmMトリスー 1 mM— EDTA緩衝液（pH7. 5 ) 100 1に懸濁させ、 超音波処理して菌体を破壊し、 得られた破砕液 3 1を SDS 一ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。 結果を第 5図 のレーン 3に示す。 第 5図のレーン 4は対照用のレーンであり、 実施例 12の組換えを行っていないプラスミドで形質転換した 大腸菌 YA21株を前記と同様に破壞し、 得られた破砕液を S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し ものである。 レーン 3の左側に矢印で示すように、 約 17kダルトンの位置 にタンパク成分が見出される。 なお、 マーカー （図示せず） と しては、 Pre-Stained SDS-PAGE Standards〔ホスホリラーゼ B (11 Okダルトン） 、 ゥシ血清アルブミン（84kダルトン） 、 オボアルブミン （47 kダルトン） 、 カルボニックアンヒドラ ーゼ（33kダルトン） 、 ダイズトリプシンインヒビター （ 2 4kダルトン） およびリゾチーム （ 16kダルトン）含有：バ ィォラッドラボラトリーズ社製〕 を用いた。
    [0149] 続いて、 分離成分をニトロセルロースのメンブランフィルタ 一に転写し、 メンブランフィルターを、 1 OmMリン酸ナトリ ゥム緩衝液〔PH7. 4 ； 0. 14 M塩化ナトリウムおよび 0. 05% (vZv) ツイン 20を含む：以下、 TPBSと称 する〕で室温で 5分間洗浄し、 更にブロッキング溶液として 2 OmMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 4 ； 3%アルブミ ンおよび 0. 5M塩化ナトリウム含有） を添加し、 37eCで 60分間静置して、 非結合部位をブロックした。 実施例 13で 得られた精製抗血清を 1500倍に希釈し、 1500倍希釈精 製抗血清 1 Om 1を前記メンブランフィルターに添加し、 4eC で一昼夜静置し、 TP BSで 3回洗浄した。 続いて、 2次抗体 を添加し、 室温で 2時間静置した。 2次抗体としては、 アル力 リホスファターゼコンジユゲート抗ゥサギ I gG (シグマ社製） の 1000倍希釈液 5m 1を使用した。
    [0150] 次に、 アルカリホスファターゼ緩衝液約 1 Om 1を添加し、 室温で 10分閬静置した後、 NBT (ニトロブルーテトラゾリ ゥム）溶液 66 1、 BC I P ( 5—プロモー 4一クロロー 3 —インドリルホスフェート）溶液 33 x 1とアルカリホスファ ターゼ緩衝液 9. 9m 1からなる基質溶液を添加し、 室温で 5 分間発色させ、 続いて 3%トリクロ口酢酸溶液を添加して反応 を停止させ、 蒸留水で洗浄した。 なお、 NBT溶液は、 NBT 5 Omgを 70%ジメチルホルムアミド lm 1に溶解して調製 し、 BC I P溶液は、 BC I P 5 Omgを 100%ホルムアミ ド lm 1に溶解して調製した。
    [0151] 結果を第 5図のレーン 1およびレーン 2に示す。 レーン 1は レーン 3を転写したものであり、 レーン 2はレーン 4 (対照用） を転写したものである。 レーン 2には抗クルクリン A抗体と反 応する成分が存在しないのに対し、 レーン 1には、 その左側に 矢印で示すように、 レーン 3の約 17kダルトンの位置に現れ たタンパク成分に相当する位置に抗クルクリン A抗体と反応す る成分が存在する。
    [0152] 参者例 1 ：水洗および塩化ナトリウム水溶液による抽出
    [0153] クルクリゴ.ラチフォリアの果肉 30 gを取り、 水 4 Om l を加えてホモジナイズし、 遠心分離（ 12 , 50 Orpin. 60分 間） した。 この上清は褐色を示し、 味覚修飾活性はなかった。 さらに得られた沈渣に、 水 4 Om 1を加えてホモジナイズし、 遠心分離（ 12， 500 rpm、 20分間） した。 この上清は、 無色で、 味覚修飾活性はなかった。
    [0154] 次に、 得られた沈渣に 0. 5 M塩化ナトリウム水溶液を加え てホモジナイズし、 遠心分離（ 30， 000 rpm、 60分間） した。 得られた上清は、 無色で味覚修飾活性を示した。 さらに、 0. 5 M塩化ナトリウム水溶液 4 Om lによる抽出操作を 3回 繰り返し、 これら 3回分の上清を合わせ、 クルクリンを含む粗 抽出液を得た。
    [0155] 参考例 2 ：硫酸アンモニゥムによる塩析
    [0156] 参考例 1で得られた粗抽出液に、 80 %飽和になるように硫 酸アンモニゥムを添加して活性物質を析出させた。 これを遠心 分離（ 32 , 00 Oipm、 60分間） して得た沈殿を 0. 01 M リン酸緩衝液（PH6. 8) 100m lに溶解した。
    [0157] 参者例 3 ： CM—セファロースイオン交換クロマトグラフィー 参考例 2で得られた溶液を、 CM—セファロース CL一 6B —カラム （直径 2. 2X l 8cm、 ベッド体積 68m l、 ファ ルマシア L KBバイオテクノロジー社製） に流し吸着させた。 続いて、 0. 01Mリン酸緩衝液（pH6. 8) で素通り面分 を除去した後、 塩化ナトリウム溶液 0〜1. 0Mの直線濃度勾 配溶出法でクルクリンを溶出した （流速 5m 1/1時間、 1分 画 5m 1、 全溶出液量 50 Om 1 ) 。 溶出したタンパク質は 280 nmの吸収によりモニターした。 その結果を第 6図に示 した。 第 6図に示すピーク （B) が味覚修飾物質クルクリンを 含む画分である。
    [0158] 参考例 4 ：分子ふるいクロマトグラフィー
    [0159] 参考例 3で得られた、 第 6図のピーク （B) の斜線部分に示 された画分に、 80%飽和になるように硫酸アンモニゥムを添 加して活性物質を析出させた。 これを遠心分離（ 32, 000 rpm、 60分間） して得た沈殿を 0. 01 Mリン酸緩衝液 (pH6. 8) 1. 5m lに溶解した。 この濃縮液をセフアデ ックス （フアルマシア LKBバイオテクノロジー社製） G— 100カラム （直径 1. 6 c mX 58 c m、 ベッド体積 160 m 1 ) を用い、 0. 5M— NaC 1を含む 0. 01 Mリン酸緩 街液（PH6. 8〉 により分離した （流速 8. m lZl時閭、 1分画 2. 8m 1、 全溶出液量 182m 1 ) 。 タンパク質は 280 nmの吸収によりモニターした。 第 7図に示すピーク (A) が味覚修飾物質クルクリンを含む画分である。
    [0160] 参者例 5 ： SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動
    [0161] 参考例 4で得られた、 第 7図のピーク （A) の斜線部分に示 された画分の物質の純度および分子量を、 8M尿素を含む、 S D S—ボリァクリルアミドゲル電気泳動により確認した。 その 結果、 分子量 12， 000ダルトンのところに単一バンドを示 したことから、 第 7図のピーク （A) の斜線部分に示された画 分の味覚修飾物質クルクリンは、 純品（クルクリン A ) である ことが確認できた。
    [0162] クルクリゴ · ラチフォリアの果肉 30 gから得られた、 各ク ルクリン画分のタンパク質含量、 活性収率および精製度は下記 第 2表に示す通りである。 なお、 タンパク質含量は、 ローリー (Lowr y ) らの方法により確定した。
    [0163] また、 活性は、 試料を 3分間口に含んだ後水で口をすすぎ、 0. 02 Mクェン酸溶液を味わった時の甘さを各種瀵度のショ 糖溶液と比較し、 同等の甘さのショ糖濃度を求めることにより 測定した。 その結果を第 8図に示す。 第 8図から判るように、 高純度のクルクリン Aの活性は、 0. 3Mショ糖の甘さに相当 した。 第 2表
    [0164]
    [0165] * 1 ：果肉重量（蛋白質以外の成分も含む） 参者例 6 ：等電点電気泳動
    [0166] ファーストシステム 〔 P h a s t S y s t e m (商標） ： フ アルマシア LKBバイオテクノロジー社製〕 により、 ファース トゲル（Phas tGe l I EF5— 8) を用いて、 高純度 クルクリン Aの等電点電気泳動を行ったところ、 等電点は 7 . 1であった。
    [0167] 産業上の利用可能性
    [0168] 本発明によれば、 本質的に純粋で安定なクルクリン Bを比較 的容易にしかも大量に提供することができる。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1 . 本質的に純粋なクルクリン B。 -
    2 . クルクリゴ · ラチフォリア由来の他のタンパク質を実質的 に含有しないクルクリン B。
    3 . 組換宿主細胞または微生物によって産生されるクルクリン B。
    4 . 以下の式（ I ) で表されるアミノ酸配列を含むペプチド： Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gin Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gin Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr lie Gin Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gin Asn Gly Arg Gin lie Tip Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val lie Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Tip Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gin Lys Asp Gly Arg Phe Val lie Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly ( I ) 。
    5 . 以下の式（Π ) で表されるアミノ酸配列を含むペプチド： Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr lie Leu Val Thr Phe Ala Ala Val Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gin Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gin Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr lie Gin Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gin Asn Gly Arg Gin lie Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val lie Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Tip Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gin Lys sp Gly Arg Phe Val lie Tyr Gly Pro Val Leu Tip Ser Leu Gly Pro sn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly Gly lie Thr Val Ala Lys Asp Ser
    Thr Glu Pro Gin His Glu Asp lie Lys Met Val lie AsnAsn ( II ) 0 6 . クルクリン Bをコードする塩基配列を含む D N A。
    7 . クルクリン B前駆体をコードする塩基配列を含む D N A。
    8 . 以下の式 （ I ) で表されるアミノ酸配列からなるポリぺプ チドをコードする塩基配列を含む D N A ：
    Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gin Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gin Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr lie Gin Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gin Asn Gly Arg Gin lie Tip Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val lie Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Tip Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gin Lys Asp Gly Arg Phe Val lie Tyr Gly Pro Val Leu Tip Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly ( I ) β
    9 . 以下の式 （II ) で表されるアミノ酸配列からなるボリべプチ ドをコードする塩基配列を含む D N A：
    Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr lie Leu Val Thr Phe Ala Ala Val Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gin Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gin Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr lie Gin Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gin Asn Gly Arg Gin He Tip Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val lie Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gin Lys Asp Gly Arg Phe Val He Tyr Gly Pro Val Leu Tip Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly Gly lie Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro GlnHis Glu Asp He Lys Met Val lie AsnAsn ( II ) 。
    1 0 . 以下の式 （IV ) で表される塩基配列を含む D N A : GAC AAT GTC CTG CTC TCC GGG
    CAA ACT CTG CAT GCC GAC CAC
    TCT CTC C AG GCG GGC GCC TAT
    ACC TTA ACC ATA CAA AAC AAG
    TGC AAC CTG GTG AAA TAC C AG
    AAC GGG AGG C AG ATC TGG GCT
    AGC AAC ACT GAC AGG CGG GGC
    TCC GGC TGC CGC CTC AC A TTG
    CTG AGT GAC GGG AAC CTC GTT
    ATC TAC GAC CAC AAC AAC AAC
    GAC GTG TGG GGG AGC GCC TGC
    TGG GGG GAC AAC GGC AAG TAT
    GCT CTT GTT CTT C AG AAG GAT
    GGC AGA TTT GTC ATC TAT GGC
    CCG GTT TTG TGG TCC CTT GGC
    CCT AAT GGG TGC CGC CGT GTT
    AAT GGT (IV) 。
    11. 以下の式（V) で表される塩基配列を含む DN A：
    ATG GCG GCC AAG TTT CTT CTC
    ACC ATT CTT GTC ACC TTT GCG
    GCC GTC GCT AGC CTT GGC ATG
    GCC GAC AAT GTC CTG CTC TCC
    GGG CAA ACT CTG CAT GCC GAC
    CAC TCT CTC C AG GCG GGC GCC
    TAT ACC TTA ACC ATA CAA AAC
    AAG TGC AAC CTG GTG AAA TAC C AG AAC GGG AGG C AG ATC TGG GCT AGC AAC ACT GAC AGG CGG GGC TCC GGC TGC CGC CTC AC A TTG CTG AGT GAC GGG AAC CTC GTT ATC TAC GAC C AC AAC AAC AAC GAC GTG TGG GGG AGC GCC TGC TGG GGG GAC AAC GGC AAG TAT GCT CTT GTT CTT C AG AAG GAT GGC AGA TTT GTC ATC TAT GGC CCG GTT TTG TGG TCC CTT GGC CCT AAT GGG TGC CGC CGT GTT AAT GGT GGA ATC AC A GTT GCT AAG GAT TCT ACT GAA CCA C AA CAT GAG GAT ATT AAG ATG GTG ATT AAT AAT ( V ) 。
    12. クルクリン Bをコードする塩基配列を含む組換 DNAを 含有する形質転換微生物または細胞を培養して前記の形質転換 微生物または細胞にクルクリン Bを産生させ、 そのクルクリン Bを前記形質転換微生物または細胞から単離することを特徴と する、 クルクリン Bの製造方法。
    13. クルクリゴ . ラチフォリアからクルクリン mRNAを含 む画分を分離し、 逆転写酵素を用いて前記 mRNAから単鎖 c DNAを作成し、 この単鎖 c DNAから二重鎖 c DNAを作成 し、 この二重鎖 c DNAをベクターに揷入し、 このベクターに より宿主を形質転換させて cDNAライブラリーを作成し、 ク ルクリゴ · ラチフォリアから精製したクルクリン Aから分析し た部分ァミノ酸配列をコードする塩基配列を含む合成 DNAを プローブとして用い、 前記ライブラリーからクルクリン Bをコ ードする cDNAを単離することを特徴とする、 クルクリン B' をコードする塩基配列を含む D N Aの製造方法。
    14. プローブとして、 式
    5，一 ATH— CAR— AAK— AAK— TGY— AA— 3，、 5，一 GC— CCA— DAT— YTG— NCK— NCC— RTT — YTG— RTA— 3，、 および
    5，一 AC— NGG— NCC— RTA— D AT— NAC—
    RAA— 3，
    (これらの式で、 Nは A、 C、 Gまたは T、 Ηは A、 Cまたは T、 Dは A、 Gまたは Τ、 Rは Αまたは G、 Kは Gまたは T、 そして Υは Cまたは Τの、 それぞれデォキシリボ核酸残基を示 す）
    で表される塩基配列を含む DN Αからなる群から選んだ少なく とも 1種の DNAを用いる、 雷事求項 13に記載の方法。
    15. プローブとして、
    5'— ATH— CAR— AAK— AAK— TGY— AA— 3， で表される塩基配列を含む D N Aと、
    5，一 GC— CCA— DAT— YTG— NCK— NCC— RTT 一 YTG— RTA— 3'、 または
    5，一 AC— NGG— NCC— RTA— DAT— NAC—
    RAA— 3，
    (これらの式で、 Nは A、 C、 Gまたは T、 Ηは A、 Cまたは T、 Dは A、 Gまたは Τ、 Rは Αまたは G、 Kは Gまたは T、 そして Υは Cまたは丁の、 それぞれデォキシリボ核酸残基を示 す）
    で表される塩基配列を含む D N A 1種または 2種とを用いる、 請求項 1 4に記載の方法。
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    CA2062174A1|1992-09-05|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1992-09-17| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): KR RU |
    1994-04-14| EX32| Extension under rule 32 effected after completion of technical preparation for international publication|Free format text: BY |
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